·       اساس روش :

کروماتوگرافی تعویض یونی از نوع تعویض آنیونی

1-   تورم رزين با بافر و به تعادل رسيدن آن با بافر تا PH رزين به PH بافر برسد

2-   اضافه نمودن هموليزات به ستون

3-   جداسازي انتخابي اجزاي نمونه بوسيله تغيير PH یا قدرت يونيك بافر

·       ذرات رزین دارای بارالکتریکی مثبت بوده که هموگلوبین بعلت دارابودن شارژمنفی به این ذرات رزین جذب گردیده و درمرحله ی بعد بااستفاده از بافر مخصوص در PHخاص هموگلوبینA2ازذرات ژل جداگردیده وبه طرف پایین حرکت میکنددر صورتیکه بقیه ی هموگلوبینها جذب ژل باقی می مانند.

در اندازه گيري هموگلوبين A2 به روش كروماتوگرافي ستوني با استفاده ازستون ميکروميتوان از بافر گلایسين يا بافر تريس استفاده نمود.

 

1)     روش گلايسين : بافر اول تركيبي از گلايسين و سيانور پتاسيم (KCN) مي باشد و بافر دوم همان تركيب بافر اول به همراه كلرور سديم مي باشد كه با اضافه نمودن نمك به بافر دوم قدرت يوني آن افزايش يافته و ساير هموگلوبين ها را از ستون خارج مي سازد. PH رزين بايد توسط HCL يك مولار و به كمك PH متر طوري تنظيم شود كه پائين تر از نقطه ايزوالكتريك هموگلوبين A2 بوده و بالاتر از نقطه ايزوالكتريك ساير هموگلوبين ها باشد ، لذا بلافاصله پس از جذب هموليزات به روی رزين و اضافه نمودن بافر اول ، هموگلوبين A2 بصورت يك حلقه از ستون خارج مي شود ، سپس با اضافه كردن بافر دوم ، با افزايش قدرت يوني ، ساير هموگلوبين ها نیز از ستون خارج مي شوند.

 

2)     روش تريس : روش پيشنهادي NCCLS مي باشد. از محلول ذخيره تريس سه بافر با 5/8 ، 3/8 ، 7  PH=به كمك HCL غليظ تهيه مي گردد. جداسازي در اين روش بر اساس تغيير در PH  بافر صورت مي گيرد. در اين روش PH بافر دوم ( 3/8 ) بسيار مهم مي باشد ( در اين PH هموگلوبين A2 از ستون خارج مي شود )

   اين روش بدليل استفاده از بافرهاي متعدد ( 3 بافر ) در آزمايشگاهها كمتر مورد استفاده قرار مي گيرد. قابل ذكر است كه درصد هموگلوبين A2 با استفاده از بافر تريس مختصري پائين تر از روش استفاده از بافرگلایسین میباشد.هم چنین در مقایسه با روش تريس ، بافر گلایسين حساسيت كمتري به تغييرات مختصر PH دارد.

 

با تهيه رزين با بافر گلايسين و PH مناسب جهت جداسازي هموگلوبين A2 مي توان نمونه هايي كه حاوي هموگلوبين S میباشند را نيز جدا كرد. ( طول رزين داخل ستون بايد افزايش يابد )

 بدليل عدم ساخت رزين و بافر در آزمايشگاهها مراحل كنترل كيفي آن ذكر نميگردد.

 

اکثركيت هاي اندازه گيري هموگلوبين A2 موجود در ايران بر اساس كروماتوگرافي تعويض يوني با استفاده از بافر گلايسين مي باشد که جدا سازی هموگلوبين A2 بافر دوم به کمک  بافر اول يا همان محلول Developer صورت می گيرد.با تهيه لولـه تـوتال ( آب مقطر به همراه هموليزات ) بجای استفاده از بافر دوم درصد هموگلوبين A2 محاسبه مي گردد.

 تهيه نمونه : خون به همراه ماده ضد انعقاد EDTA مناسب مي باشد. حداكثر زمان نگهداري خون در دماي چهار درجه ( يخچال ) 8 روز مي باشد . بهتر است هموليزات تازه و در روز آزمايش تهيه شود.

 دامنه مرجع:

در کتب مرجع پیشنهاد میگردد که هر آزمایشگاه دامنه مرجع خود را با استفاده از حداقل 20 نمونه خون فرد سالم (هموگلوبین واندکس های گلبولی طبیعی ) بدست اورد و تفسیر نتایج هموگلوبين  A2در مقابل این دامنه صورت گیرد.قابل ذکر است که دامنه مرجع ممکن است مختصری در روش های مختلف اندازه گیری هموگلوبين  A2ودر بین آزمایشگاهها متفاوت باشد. (دامنه مرجع ممکن است در روش  HPLC 0.1-0.2% بالاتر باشد.)

بطور معمول دامنه مرجع هموگلوبين A2 برطبق توصیه NCCLS، 5/3-5/1%می باشد در حالی که کتاب خون شناسی   Dacie3/3-2% را پیشنهاد میکند. در ایران نیز بنظر می رسد که دامنه پیشنهادی فوق قابل قبول تر باشد.

در نهایت بدنبال تعیین دامنه مرجع هم ،هنوز مشکلاتی در تفسیر نتایج لبه مرزی Border line وجود دارد.دراین موارد تکرار نتایج نیز ممکن است0.1-0.2% تفاوت نشان دهد.طبق پیشنهاد کتاب خون شناسیDacie بهتراست نتایج 3.4-3.7% هموگلوبین A2  بعنوان لبه مرزی در نظر گرفته شود و هموگلوبین A2  در همان نمونه ویک نمونه مجدد تازه تکرار شود.

* تفسیر نتایج هموگلوبین A2  باید در کنارشمارش گلبولهای قرمز، میزان هموگلوبین، اندکس های گلبولی وبررسی گسترش خون محیطی فرد صورت گیرد.در نهایت در موارد مشکوک و لبه مرزی باید بررسی فامیلی و آزمایش های تکمیلی نظیر جدا سازی زنجیره ها وبررسی DNA صورت گیرد. 

دامنه مرجع%

تفسیر

7<

- وجود هموگلوبین  A2به تنهائی بسیار نادر است

- موارد نادر موتاسیونهای β تالاسمی

7-3.8

- صفت  β تالاسمی- هموگلوبین ناپایدار

- صفت هموگلوبین S- آنمی داسی شکل- آنمی مگالوبلاستیک

3.7-3.4

- فقر اهن بسیار شدیدهمراه با صفت  β تالاسمی

- همراهی واریانت های زنجیره دلتا( ς ) با صفت  β تالاسمی

- تاثیر متقابل تالاسمیα و β

- موتاسیونهای نادر  β تالاسمی

- حضور هموگلوبین S  (در این مورد صحت اندازه گیری هموگلوبین A2مشکل میشود )

-  تاثیر متقابل تالاسمیα و هموگلوبین S

- خطاهای آنالیتیکال(آزمایش باید تکرار شود)

3.3-2

- فرد طبیعی

- دلتا بتا ( ς  β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد)

- موارد نادر صفت  β تالاسمی(شامل همراه شدن β با دلتا تالاسمی و α و β تالاسمی)

صفت αتالاسمی  

2>

- دلتا بتا ( ς  β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد)

- صفت αتالاسمی 

- بیماری هموگلوبین H

- حضور واریانت های زنجیره دلتا

 

 اندازه گيری هموگلوبين A2به روشHPLC

در اين روش از ستون های تعويض کننده کاتيونی استفاده می گردد و دارای دقت و صحت قابل قبول می باشد.پس از جدب هموليزات در ستون ،با تغيیر قدرت يونی بافرواريانت های هموگلوبين قابل جدا سازی می باشند.هموگلوبين ها براساس شارژ الکتريکی خود در زمان مشخصی Retention Time ازستون خارج می گردنند،که مبنای جدا سازی اين متد می باشد.

مزايا:

- حجم کم نمونه( در حدود 5ميکرو ليتر)

- زمان کوتاه اندازه گيری

- تعيين درصد هموگلوبين A2,Fوبسياری از واريانت های هموگلوبين در هر سری کاری(هموگلوبين های S,C قابل جداسازی اند)

 معايب :

-هموگلوبين Lepore ,Eبطور همزمان با هموگلوبين A2از ستون خارج می شوند.در اين موارد بايد از روش های تکميلی تائيد کننده استفاده گردد.

- هموگلوبين Dايران با هموگلوبين A2همزمان از ستون خارج می گردنند

-هزينه بالا

 الکتروفورزاستات سلولز همراه با الوشن

 بدنبال الکتروفورز استات سلولز وجداسازی باند ها،منطقه هر باند بريده شده و عمل الوشن در مجاورت آب مقطر صورت خواهد گرفت . با خواندن جذب نمونه در مقابل لوله شاهد در طول موج 415 نانومتر درصد هموگلوبين تعيين می گردد.

قابل ذکر است که اين روش جهت تعيين درصد هموگلوبين A2 درحضور ساير هموگلوبين های همبار با هموگلوبين A2 از صحت مناسب برخوردار نمی باشد.